1.1. Objetivos del trabajo
Los objetivos del trabajo propuesto consisten en el análisis bioinformática del gen lacZ de Pseudoalteromonas haloplanktis, el cual codifica la proteína betagalactosidasa. Para ello, se realizará un primer estudio en bases de datos moleculares y una búsqueda de similitud con otras proteínas relacionadas. Tras esto, se llevará a cabo un análisis exhaustivo de las secuencias conservadas en nuestra proteína por medio de matrices de puntos y alineamientos múltiples entre las proteínas relacionadas, con el fin de determinar qué regiones proteicas son importantes desde el punto de vista catalítico y estructural. A continuación, una búsqueda en bases de datos de motivos y dominios proteicos verificará los resultados obtenidos anteriormente y permitirá aclarar nuestras conclusiones, permitiendo enmarcar la proteína en una/s familia/s proteica concreta. Por último, un estudio minucioso de la estructura tridimensional de la betagalactosidasa en comparación con los resultados obtenidos en el resto del trabajo proporcionará información sobre la localización de los dominios catalíticos y motivos proteicos conservados, así como su papel en la actividad catalítica.
1.2. Elección del gen
La razón por la que hemos elegido este gen es que parece ser un gen interesante a la hora de su estudio por las implicaciones biotecnológicas a las que está suscrito?. En concreto, se sabe que los problemas de intolerancia a la lactosa son muy frecuentes en humanos, posiblemente, porque nuestra especie no está creada para tomar leche en edad adulta. Sin embargo, la leche provee a nuestro organismo de multitud de vitaminas, minerales y proteínas beneficiosas que no deben ser eliminadas de nuestra dieta. Por ello, la eliminación de la lactosa como azúcar principal de la leche de forma eficiente es un proceso muy importante y que debe ser lo más barato posible, evitando cambiar mínimamente las propiedades organolépticas de la leche que, normalmente se encuentra refrigerada para evitar el crecimiento de microorganismo. De esta forma, la betagalactosidasa de Pseudoalteromonas haloplanktis puede ser de gran importancia por su característica baja temperatura de catálisis (entorno a 4ºC tiene su máxima actividad).
1.3. Biología de Pseudoalteromonas haloplanktis Pseudoalteromonas haloplanktis es una bacteria marina gram negativa pricrófila antártica, en forma de varilla curvada (0.2 to 1.5 by 1.8 to 3 µm). Pertenece al domino Bacteria, filo Proteobacteria, clase Proteobacteria gamma, orden Alteromonadales, familia Pseudoalteromonadaceae, género Pseudoalteromonas. Esta bacteria no forma esporas, no es luminiscente y se mueve gracias a un flagelo polar. Se encuentra normalmente creciendo a temperaturas de entorno a -20ºC frente a las costas de la Antártida. Es un microorganismo aerobio sin metabolismo fermentativo, quimioautótrofo. Tan sólo se encuentra secuenciado parte del genoma de esta bacteria, aunque no se encuentra disponible en ninguna base de datos. Existe una cepa llamada TAC 125 que si tiene secuenciado su genoma, el cual consiste en 2 cromosomas circulares de una longitud total de 3,5 Mb, aunque ésta no contiene el gen lacZ (El cromosoma I tiene un contenido en G+C del 40%, codificando 2940 proteínas distintas; mientras que el cromosoma II codifica 546 proteínas y posee un contenido de G+C del 39%). Las proteínas de esta bacteria esta siendo objeto de estudio debido a que actúan con alta eficiencia a baja temperatura.
1.4. Características biológicas y catalíticas de la proteina lacZ El gen lacZ contiene 3117 nucleótidos que codifican una betagalactosidasa de 1039 aminoácidos. Al tratarse de un organismo procariota, toda la secuencia es codificante. Este gen se ha encontrado en varias cepas de la especie Pseudoalteromonas haloplanktis y comparte función, estructura y parte de su secuencia con varios genes que codifican betagalactosidasas en bacterias como E. coli y levaduras como Kluyveromyces lactis. Esta proteína está formada por cuatro protómeros idénticos de 116,248 Da, conteniendo cada uno un sitio activo; su estructura general, por tanto, es de homotetrámero. Tiene su punto isoeléctrico a pH 7,8 y una KM de 2,4 mM para lactosa a pH 7,5 y 25ºC de temperatura. Presenta actividad máxima a pH 8,5 y 4ºC. Además, esta proteína necesita la unión de varios cofactores para tener una actividad óptima, ya que une dos iones de magnesio (puede unir también manganeso, litio y calcio) y un ión de sodio por monómero. Respecto a su regulación en la naturaleza, se sabe que se inhibe por la presencia en el medio de iones de zinc, cobre y niquel. In vitro, puede activarse con 2-mercaptoetanol e inhibirse con EDTA.
La función biológica de esta proteína es meramente catalítica y consiste en la hidrólisis del enlace β-1,4-galactosídico que une residuos no reducidos de beta-D-galactosa pertenecientes a beta-D-galactosidasas, como es el caso de la lactosa, compuesta por glucosa y galactosa. De esta forma, pueden hidrolizar las galactosidasas en sus monómeros para degradarlos posteriormente y obtener energía.
1.5. Proceso biotecnológico asociado
Esta betagalactosidasa adaptada al frío ha llamado la atención de los investigadores por su capacidad de hidrolizar la lactosa de la leche y de productos lácteos producidos y almacenados en plantas refrigeradas, debido a los problemas nutricionales (intolerancia a la lactosa), tecnológicos (cristalización de la enzima) y ambientales (polución) asociados con este principal carbohidrato de la leche. De hecho, su actividad es superior a la enzima usada actualmente en este proceso, procedente de Kluyveromyces marxiamus. Además, tiene la ventaja de que puede ser producida en grandes cantidades tras un proceso de clonaje en E. coli, abaratando así el coste de producción y purificación.
1.6. Enfermedad causante del nacimiento del proceso biotecnológico
La lactosa es uno de los principales azúcares que contiene la leche humana y de otras especies. En concreto, se trata de un disacárido formado por glucosa y galactosa. Para su digestión es necesaria la presencia de la enzima lactasa en el borde las células intestinales, que separa la lactosa en sus dos componentes. La falta de esta enzima en el organismo provoca el paso directo de la lactosa sin procesar al intestino grueso, lo que provoca un desequilibrio osmótico que conlleva una entrada de agua en el intestino. Además, las bacterias colonizadoras del intestino grueso son capaces de degradar la lactosa y producir gases y ácido. Todas estas reacciones indeseadas promueven en las personas intolerantes a la lactosa una serie de síntomas como las evacuaciones líquidas y ácidas y un aumento de los gases.
La intolerancia a la lactosa es un problema raro causado por la deficiencia congénita del gen de la lactasa que afecta a los humanos, normalmente, poco después del nacimiento. En concreto, ésta es una enfermedad rara que se transmite de forma autonómica recesiva y que conlleva la imposibilidad de absorción de la lactosa por la ausencia total de la enzima lactasa. Así también, existe una intolerancia adquirida a la lactosa que aparece frecuentemente después del segundo año de vida, tras el período de lactancia del bebé, hasta el cuál el niño toleraba la lactosa sin problemas, incrementándose su incidencia hasta llegar a edad adulta. Por último, existe igualmente un tipo de enfermedad frecuente en humanos que consiste en la intolerancia transitoria a la lactosa debido a un problema infeccioso, inflamatorio o alérgico intestinal que imposibilita la absorción de lactosa por la pérdida de la enzima lactasa, aunque, una vez corregido el problema, se revierte la intolerancia.
1.1. Objetivos del trabajo
Los objetivos del trabajo propuesto consisten en el análisis bioinformática del gen lacZ de Pseudoalteromonas haloplanktis, el cual codifica la proteína betagalactosidasa. Para ello, se realizará un primer estudio en bases de datos moleculares y una búsqueda de similitud con otras proteínas relacionadas. Tras esto, se llevará a cabo un análisis exhaustivo de las secuencias conservadas en nuestra proteína por medio de matrices de puntos y alineamientos múltiples entre las proteínas relacionadas, con el fin de determinar qué regiones proteicas son importantes desde el punto de vista catalítico y estructural. A continuación, una búsqueda en bases de datos de motivos y dominios proteicos verificará los resultados obtenidos anteriormente y permitirá aclarar nuestras conclusiones, permitiendo enmarcar la proteína en una/s familia/s proteica concreta. Por último, un estudio minucioso de la estructura tridimensional de la betagalactosidasa en comparación con los resultados obtenidos en el resto del trabajo proporcionará información sobre la localización de los dominios catalíticos y motivos proteicos conservados, así como su papel en la actividad catalítica.
1.2. Elección del gen
La razón por la que hemos elegido este gen es que parece ser un gen interesante a la hora de su estudio por las implicaciones biotecnológicas a las que está suscrito?. En concreto, se sabe que los problemas de intolerancia a la lactosa son muy frecuentes en humanos, posiblemente, porque nuestra especie no está creada para tomar leche en edad adulta. Sin embargo, la leche provee a nuestro organismo de multitud de vitaminas, minerales y proteínas beneficiosas que no deben ser eliminadas de nuestra dieta. Por ello, la eliminación de la lactosa como azúcar principal de la leche de forma eficiente es un proceso muy importante y que debe ser lo más barato posible, evitando cambiar mínimamente las propiedades organolépticas de la leche que, normalmente se encuentra refrigerada para evitar el crecimiento de microorganismo. De esta forma, la betagalactosidasa de Pseudoalteromonas haloplanktis puede ser de gran importancia por su característica baja temperatura de catálisis (entorno a 4ºC tiene su máxima actividad).
1.3. Biología de Pseudoalteromonas haloplanktis
Pseudoalteromonas haloplanktis es una bacteria marina gram negativa pricrófila antártica, en forma de varilla curvada (0.2 to 1.5 by 1.8 to 3 µm). Pertenece al domino Bacteria, filo Proteobacteria, clase Proteobacteria gamma, orden Alteromonadales, familia Pseudoalteromonadaceae, género Pseudoalteromonas. Esta bacteria no forma esporas, no es luminiscente y se mueve gracias a un flagelo polar. Se encuentra normalmente creciendo a temperaturas de entorno a -20ºC frente a las costas de la Antártida. Es un microorganismo aerobio sin metabolismo fermentativo, quimioautótrofo. Tan sólo se encuentra secuenciado parte del genoma de esta bacteria, aunque no se encuentra disponible en ninguna base de datos. Existe una cepa llamada TAC 125 que si tiene secuenciado su genoma, el cual consiste en 2 cromosomas circulares de una longitud total de 3,5 Mb, aunque ésta no contiene el gen lacZ (El cromosoma I tiene un contenido en G+C del 40%, codificando 2940 proteínas distintas; mientras que el cromosoma II codifica 546 proteínas y posee un contenido de G+C del 39%). Las proteínas de esta bacteria esta siendo objeto de estudio debido a que actúan con alta eficiencia a baja temperatura.
1.4. Características biológicas y catalíticas de la proteina lacZ
El gen lacZ contiene 3117 nucleótidos que codifican una betagalactosidasa de 1039 aminoácidos. Al tratarse de un organismo procariota, toda la secuencia es codificante. Este gen se ha encontrado en varias cepas de la especie Pseudoalteromonas haloplanktis y comparte función, estructura y parte de su secuencia con varios genes que codifican betagalactosidasas en bacterias como E. coli y levaduras como Kluyveromyces lactis. Esta proteína está formada por cuatro protómeros idénticos de 116,248 Da, conteniendo cada uno un sitio activo; su estructura general, por tanto, es de homotetrámero. Tiene su punto isoeléctrico a pH 7,8 y una KM de 2,4 mM para lactosa a pH 7,5 y 25ºC de temperatura. Presenta actividad máxima a pH 8,5 y 4ºC. Además, esta proteína necesita la unión de varios cofactores para tener una actividad óptima, ya que une dos iones de magnesio (puede unir también manganeso, litio y calcio) y un ión de sodio por monómero. Respecto a su regulación en la naturaleza, se sabe que se inhibe por la presencia en el medio de iones de zinc, cobre y niquel. In vitro, puede activarse con 2-mercaptoetanol e inhibirse con EDTA.
La función biológica de esta proteína es meramente catalítica y consiste en la hidrólisis del enlace β-1,4-galactosídico que une residuos no reducidos de beta-D-galactosa pertenecientes a beta-D-galactosidasas, como es el caso de la lactosa, compuesta por glucosa y galactosa. De esta forma, pueden hidrolizar las galactosidasas en sus monómeros para degradarlos posteriormente y obtener energía.
1.5. Proceso biotecnológico asociado
Esta betagalactosidasa adaptada al frío ha llamado la atención de los investigadores por su capacidad de hidrolizar la lactosa de la leche y de productos lácteos producidos y almacenados en plantas refrigeradas, debido a los problemas nutricionales (intolerancia a la lactosa), tecnológicos (cristalización de la enzima) y ambientales (polución) asociados con este principal carbohidrato de la leche. De hecho, su actividad es superior a la enzima usada actualmente en este proceso, procedente de Kluyveromyces marxiamus. Además, tiene la ventaja de que puede ser producida en grandes cantidades tras un proceso de clonaje en E. coli, abaratando así el coste de producción y purificación.
1.6. Enfermedad causante del nacimiento del proceso biotecnológico
La lactosa es uno de los principales azúcares que contiene la leche humana y de otras especies. En concreto, se trata de un disacárido formado por glucosa y galactosa. Para su digestión es necesaria la presencia de la enzima lactasa en el borde las células intestinales, que separa la lactosa en sus dos componentes. La falta de esta enzima en el organismo provoca el paso directo de la lactosa sin procesar al intestino grueso, lo que provoca un desequilibrio osmótico que conlleva una entrada de agua en el intestino. Además, las bacterias colonizadoras del intestino grueso son capaces de degradar la lactosa y producir gases y ácido. Todas estas reacciones indeseadas promueven en las personas intolerantes a la lactosa una serie de síntomas como las evacuaciones líquidas y ácidas y un aumento de los gases.
La intolerancia a la lactosa es un problema raro causado por la deficiencia congénita del gen de la lactasa que afecta a los humanos, normalmente, poco después del nacimiento. En concreto, ésta es una enfermedad rara que se transmite de forma autonómica recesiva y que conlleva la imposibilidad de absorción de la lactosa por la ausencia total de la enzima lactasa. Así también, existe una intolerancia adquirida a la lactosa que aparece frecuentemente después del segundo año de vida, tras el período de lactancia del bebé, hasta el cuál el niño toleraba la lactosa sin problemas, incrementándose su incidencia hasta llegar a edad adulta. Por último, existe igualmente un tipo de enfermedad frecuente en humanos que consiste en la intolerancia transitoria a la lactosa debido a un problema infeccioso, inflamatorio o alérgico intestinal que imposibilita la absorción de lactosa por la pérdida de la enzima lactasa, aunque, una vez corregido el problema, se revierte la intolerancia.
Muy bien